环肽的合成

多肽药物在治疗上的重要性，越来越引起广大药学工作者的重视。根据肽链的构成可将多肽分为同聚肽（Homomeric）和杂聚肽（Heteromeric）两大类，前者完全由氨基酸组成，后者是由氨基酸部分和非氨基酸部分组成的，如糖肽。根据肽键的结构又分为直链肽和环肽。其中直链肽的研究最为广泛和深入，尤其在直链肽的合成技术方面无论是液相法还是固相法都已成熟。虽然许多直链肽体外具有很好的生物活性和稳定性，但是进入体内后活性很快消失。因为体内环境复杂，存在各种各样的酶。直链肽在酶的作用下很快降解，导致活性丧失。另外，直链肽在液相里的构象柔性使得不大容易符合受体的构象要求。这些不利因素造成多肽药物仍有许多问题有待解决。为了得到生物活性优秀半衰期长，受体选择性高的多肽，文献报道过很多多肽改造的方法，其中包括将直链肽改造成环肽。这种大环分子具有明确的固定构象，能够与受体很好地契合，加上分子内不存在游离的氨端和羧端使得对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低。一般地说，环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽

根据环肽的环合方式又分为首尾相连环肽（Head-to-tail）、侧链和侧链相连环肽(Sidechain-to-sidechain)、侧链和端基相连环肽（Sidechain-to-end）、含二硫桥的环肽（Disufide-bridge）、以及含有其他桥连结构的环肽。从合成方法上讲，首尾相连的环肽的合成难度最大。因为环肽的前体-直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更偏爱形成反式构象，呈舒展状态，造成属于反应中心的端基的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内缩合反应，有利于分子间缩合。

首尾相连的环肽通常是N端和C端游离的直链肽在稀溶液中（10-3~10-4M）由羧基和氨基形成酰氨键来合成。直链前体中的氨基酸种类和数目对成环的难易程度和环肽的收率起着至关重要的作用。甘氨酸、脯氨酸或D-构型氨基酸具有诱导b-转角（b-Turn）的作用，常被认为可增加成环的可能性和收率

合成首尾相连环肽的经典方法

1 活泼酯法

　　活泼酯法中活化羧基和环合反应是分两步进行的。活泼酯相对很稳定，一般不需要纯化可直接用于环合反应。几乎所有可用于偶联反应的活泼酯都可用于合成环肽，主要有对硝基酚酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酯和2,4,5-三氯苯酚酯。线性多肽的C端羧基与对硝基酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚或2,4,5-三氯苯酚，在DCC或其他缩合剂存在下，于低温反应，很容易得到相应的活泼酯。这种N端通常带有BOC或Z保护的活泼酯在酸性条件下脱去保护基，形成活泼酯的氢卤酸盐，在弱碱性稀溶液中，如在吡啶，DMF或二氧六环一类介电常数较大的溶剂中，保持pH 8~9，加热（60~100°C）或室温搅拌数小时至数日，最终可得到环肽。

1.2 迭氮法

　　在多肽合成中迭氮法是另一种比较经典的方法，这种方法的优点在于很少引起消旋反应，最早用于直链肽的合成，现在常常被用于环肽的合成。具体方法是，把直链肽的甲酯，乙酯，苄酯，取代苄酯或其它更活泼的酯通过肼解的方式生成酰肼，溶于醋酸或盐酸-醋酸混合溶液，在-5°C左右的温度下加入1M的亚硝酸钠溶液，产生的亚硝酸则与酰肼反应生成迭氮物。N端游离的直链肽迭氮物于4°C 搅拌一天再升温至室温，可得环肽。

固相法合成环肽

固相法能够有效地避免环合过程中二聚、多聚等副反应的发生。早在60年代，Fridkin等就应用高分子载体来合成环肽[75]。线性多肽的C端羧基与树脂形成酯键而将线性肽挂在树脂上，脱去N端保护基后，以三乙胺中和，室温12小时后得到60%~80%收率的环肽，具体过程如下：

近年来发展起来的通过氨基酸侧链与树脂连接合成环肽的策略在环肽合成中应用广泛。对具有天冬氨酸或谷氨酸残基的线性多肽，可选择这两个酸性氨基酸残基的侧链羧基为C端，与PAC(烷氧基苄醇)或PAL(烷氧基苄胺)或其他类型树脂缩合，将线性多肽挂在树脂上。主链羧基用烯丙基保护。逐步接肽完成之后脱去N端和C端保护基，加入缩合剂得到连在树脂上的环合产物。最后用三氟醋酸：茴香硫醚：b-巯基乙醇：苯甲醚混合试剂从树脂上切下环肽，同时脱去其它侧链保护基。

4. 酶法合成环肽：

　　在缓冲液中利用蛋白酶合成环肽也是正在发展的方法之一。Jackson等报道了以线性多肽酯的衍生物为底物，通过酶催化成环的方法合成了几个包含12~25个氨基酸残基头尾相接的环肽，环化用的酶Subtiligase是枯草杆菌蛋白酶突变的产物，催化反应体系为pH=8的缓冲溶液。用HPLC检测，收率在30%~80%之间。环化效率与肽的序列和长度有关。利用Subtiligase合成环肽所需的线性肽的最小长度是12个氨基酸残基，低于此数将得到水解产物或线性肽二聚产物。可能是因为低于12个残基的肽底物形成的头尾相接的空间构象不能与酶的活性中心匹配。

 环二肽的合成：

　　环二肽(2,5-哌嗪二酮)是最小的环肽，许多天然环二肽化合物都具有明确的生物活性，例如作为抗生素，苦味剂，植物生长抑制剂以及激素释放抑制剂等。环二肽结构的特殊性使得这类化合物的合成自成体系，通常由N端游离的直链肽酯在极性溶剂中回流，便可以很容易地得到目的物。Fischer虽然在甲醇氨中氨解线性二肽甲酯而得到环二肽，但同时发现这种方法易引起消旋。Nitecki提出将N端游离的线性二肽甲酯在丁醇和甲苯的混合溶剂中回流合成环二肽不会造成消旋。Ueda使用甲醇为溶剂进行回流，也得到了很好收率的环二肽；Cook等人应用1,2-乙二醇作为反应溶剂，得到了两种非对映异构体环二肽，总收率达64.5%。最近汪有初等报道了参照Ueda和Cook的方法合成了一系列环二肽，收率在55%~99%之间，并且通过生物活性实验发现Cyclo(Phe-Pro)，Cyclo(Ile-Ile)和Cyclo(Met-Met)具有轻微的钙拮抗效应，Cyclo(Ala-Ala)和Cyclo(Pro-Pro)则显示了增强钾所致的收缩效应。

参考文献

1 Takashi Mizuma,Satoshi Masubushi,Shoji Augzu J.Pharm. Pharmacol. 1997,49,1067-1071

2 Pauletti,G.M.,Okumu,F.W.,Borchardt,R.T., Parm. Res. 1997, 4,164

3 Hruby,V.J.,Al-obeidi,F.,Kazmierski,W., Biochem. J. 1990,268,249

4 Marshell,G., Tetrahedron 1993,49,3547-3558

5 Jackson,s.,Degrado,W.,Dwivedi,A.,Parthasarathy A., J. Am. Chem. Soc. 1994,116,3220-3230

6 Morgan,B.P.,Bartlett,P.A.,Holland,D.R.,Matthews,B.W., J.Am. Chem. Soc. 1994,116,3251-3260

7 Bitern,G.,Sukhotinsky,I.,Mashriki,Y., Int.J. Pept. Protein Res. 1997,49,421-426

8 Friedler,A.,Zakai,N.,Kami,C.,Broder,T.C., Biochem 1998,37,5616-5622

9 Fairlie,D.P.,Abbenante,G.,March,D.R., Curr. Med. Chem. 1995,2,654-686

10 Bruce J,Aungst and Hirosi Saitoh, Pharmaceutical Researc 1996,13(1),114-119

11 Dae-Yeon Suh,Yong Chul Kim,Young-Hwa Kang J.Nat. Prod. 1997,60,265-269

12 Bogdanowich-Knipp,S.J.,Jois D.S.S.,Siahaan T.J. J. Pept. Res. 1999,53,523-529

13 Dermoc Cox,Toshiaki Aoki,Jiro Seki,Yukio Motoyama, keizo Yoshida Med. Res. Rev. 1994,14(2),195-228