实验的多肽纯度如何选择？

肽的纯度是很重要的指标，纯度的选择取决于实验的目的。对不太灵敏的筛选实验，建议使用粗品或>75%，对免疫级别，建议选用>85%。对于受体与LIGAND相互作用的研究，生物ASSAY研究，或细胞水平的研究，建议>95%，对于结构研究，建议>98%。

具体：

>70% 免疫动物用于制备多克隆抗血清、抗体滴度的ELISA测定

>80% 酶底物非定量研究、多克隆抗体产品、Western blotting的非定量肽封闭、磷酸化反应、免疫组化和体外生物学分析、偶联树脂用于亲和层析、蛋白电泳、包被组织培养板用于细胞粘附、多肽组化研究（非定量）

>90% 定量试验设计、试管内活体鉴定研究、单克隆抗体产品

>95% 定量ELISA或RIA标准品、定量的受体-配基作用研究、体外的生物学测定、体内研究、定量封闭和竞争分析、定量蛋白酶研究、酶学研究、色谱分析标准、NMR分析部分较长或较难合成的多肽药的纯度标准

>98% 小肽药物的原料药纯度标准、分子较长的肽药的对照品标准（用于结构确证等）

>99% 药物标准品或对照品，用于结构确证

纯度是一个相对概念，没有绝对的纯度，产品的纯度与其检测手段关系密切。而多肽的纯度通常是指利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测出的纯度，即在一定波长的紫外光检测器下目标多肽峰面积占总峰面积的百分含量，其数值与仪器状态以及实验条件密切相关，下面对几个主要参数进行介绍

       检测波长（Wavelength）：多肽中的肽键即酰胺键，通常在220 nm处有较强吸收（与蛋白质类似），所以一般选用220 nm作为多肽的检测波长；某些多肽中含有苯环结构如Trp、Tyr或染料分子等，也可采用275 nm作为检测波长进行检测以作参考。

色谱柱类型（Column）：色谱柱是高效液相色谱中最关键的部件，其塔板数直接决定了杂质分子在仪器中的分离度。在多肽的HPLC分析检测中常用色谱柱的参数为：C18（反相材料）, 4.6 mm（色谱柱内径）× 250 mm（色谱柱长度），5 μm（硅胶粒径），100 ?（硅胶孔径）。这类色谱柱的柱效至少在10000以上，低柱效的色谱柱分离度较低，从而使纯度结果偏高。

        梯度（Gradient）：多肽检测中常用梯度洗脱，即洗脱剂中有机相（主要指乙腈）比例随时间逐步增高。有机相的增加速率对纯度结果有重大影响，增加速率过快会导致杂质与主产物来不及分离而堆积到一起，不能产生有效分离，得出的纯度数据“水分”过大。通常采用的是每分钟增加一个梯度的洗脱方式（乙腈浓度每分钟增加1%, v/v）。进一步降低梯度的增加速率对普通多肽样品意义不大，且会增加每个样品的检测时长，故而一般不采用。

        溶剂（Solvents）：溶剂选择不当也可能影响纯度检测的结果，主要需注意以下几点：确保多肽样品完全溶解，得到澄清溶液；尽量避免使用DMF/DMSO/AcOH等在220 nm处具有紫外吸收的溶剂；多肽序列中含有不稳定的氨基酸残基或修饰时配备的多肽溶液要尽快使用等。

        在以上几个参数（我们称其为多肽检测的WCGS标准）都能确定的情况下，绝大多数多肽的HPLC纯度也就相应地确定下来，只有这样的纯度信息应用到实验结果的分析时才更有实际意义。